PCR擴增試劑盒使用后可擴增出多條DNA片段
瀏覽次數:891發(fā)布日期:2021-08-19
PCR擴增試劑盒是從克隆有ThermuaquaticusDNAPolymerase基因的大腸桿菌經(jīng)誘導表達后,再經(jīng)三次過(guò)柱純化分離出來(lái)的一個(gè)約94KD的重組蛋白。無(wú)外源核酸酶和細菌DNA污染,穩定性好,特異性強,適用于各種PCR擴增。本試劑盒已經(jīng)包括了PCR擴增使用的各種試劑,便于客戶(hù)配套使用。使用本制品擴增得到的PCR產(chǎn)物的3'端附有一個(gè)A堿基,因此可直接克隆于T-Vector中。
所謂多重PCR(MultiplexPolymeraseChainReaction,mPCR),也稱(chēng)復合PCR,由Chambehian'在1988年提出(Chambehian'et.al.NucleicAcidsRes.1988Dec9;16(23):11141–11156.),基本原理與常規PCR相同,區別在于多重PCR的反應體系是加入多對引物,各對引物分別結合在模板的相應位置,擴增出多條DNA片段。
PCR擴增試劑盒實(shí)驗注意事項:
1.進(jìn)行PCR反應前,可以將所有g(shù)DNA的濃度稀釋到同一濃度,并轉移到PCR8聯(lián)管中,一方面是便于排槍操作,另一方面是加入相同起始量的gDNA,這樣可以降低文庫的濃度差異,便于混合文庫。
2.大多數情況下引物是1管,操作相當方便;當目標區域是外顯子或者是其他連續區域時(shí),我們會(huì )把引物分裝為2管,分別命名PrimerpoolT1與PrimerpoolT2,這時(shí)需要第二輪PCR前把產(chǎn)物合并,再進(jìn)行下一步反應。
3.執行多重PCR反應時(shí),特別是樣本量多的情況下,可以將T1設為一組,T2設為一組,便于制備反應試劑混合液和排槍操作;并把解凍好的試劑放置在冰盒上,在冰盒上進(jìn)行加樣操作。
4.在實(shí)驗中,可以在PCR管壁上和管蓋上同時(shí)進(jìn)行反應編號標記,防止高溫或其他原因導致記號消失,避免后續產(chǎn)物混合操作失誤,造成樣本交叉污染。
5.第二輪PCR后,因為YFBufferB試劑比較粘稠,在清洗純化的時(shí)候不能吸走所有試劑,可以剩余5-10μl,否則會(huì )把磁珠一起吸走,造成樣品的損失,導致產(chǎn)物回收率下降。